兽医动物疫病ELISA试剂盒实验注意事项
（专门针对猪瘟、蓝耳、伪狂、口蹄疫、腹泻、圆环等猪病ELISA）
一、样本采集与保存（最容易出问题）
1. 血清样本- 采血后室温静置2～4h或4℃过夜，待自然析出血清。
- 严禁溶血、严重脂血、黄疸，会明显升高背景值。
- 当天检测：2～8℃保存；
超过24h：-20℃冻存，避免反复冻融＞3次。
2. 组织/粪便/咽拭子- 组织必须充分研磨、离心取上清，避免残渣。
- 粪便样本尽量新鲜，避免腐败，否则非特异性反应高。
3. 禁止使用- 污染、浑浊、反复冻融、抗凝剂不当的样本。
- 用过免疫抑制剂、高浓度消毒剂的样本可能干扰。
二、试剂准备
1. 试剂盒从冰箱取出后，必须室温平衡20～30分钟再开瓶。
2. 浓缩洗涤液使用前观察是否结晶，温水浴溶解完全后再稀释。
3. 标准品/对照品严格按说明书稀释，梯度要准，混匀轻柔。
4. 酶结合物、底物液避光，现用现取，用后盖紧。
三、加样操作
1. 加样时枪头不要碰到孔壁，避免交叉污染。
2. 每孔加样量要精准，不可有气泡。
3. 对照孔、样本孔、空白孔严格区分，不要加错。
4. 批量大时尽量分批加样，避免前后反应时间差太大。
四、温育（温度=准确性）
1. 严格按说明书：37℃水浴或恒温孵箱。
2. 封板膜一定要贴紧，防止蒸发导致边缘孔异常。
3. 时间到立即进入下一步，不要随意延长温育。
4. 避免阳光直射，尤其底物显色阶段。
五、洗涤（ELISA成败关键）
1. 洗涤不彻底 = 背景高、假阳性
2. 每孔加满洗涤液，浸泡30～60秒，彻底甩干。
3. 最后一次在吸水纸上用力拍干，无残留液滴。
4. 手工洗板动作尽量一致；机器洗板检查针头是否通畅。
六、显色与终止
1. 底物液加入后避光反应，观察颜色到微蓝色/淡黄色即可终止。
2. 加终止液后轻轻震荡混匀，立即读数。
3. 终止后15分钟内完成检测，放置过久结果漂移。
七、结果判定与质控
1. 实验有效必须满足：- 空白对照OD值很低
- 阴性对照正常
- 阳性对照呈明显阳性
2. 动物疫病ELISA常用：- 阻断法、间接法、竞争法，判定公式不同，严格按说明书公式计算。
3. 复孔CV值过大、曲线异常，说明操作不均一，应重做。
八、常见动物ELISA坑点
1. 猪血清干扰强：容易出现高背景，样本一定要清亮。
2. 疫苗免疫干扰：
抗体检测ELISA无法区分野毒感染与疫苗免疫，需结合临床。
3. 不同试剂盒判定标准不同
不可混用不同厂家的Cut-off值。
4. 消毒残留
板孔、器具若有酒精、次氯酸钠残留，会严重抑制反应。
九、安全与环保
1. 动物样本按感染性废弃物处理，高压灭菌后丢弃。
2. 底物液、终止液有腐蚀性，避免接触皮肤和衣物。
3. 操作时戴手套、口罩，保持生物安全。
